Futuros designers como agentes de mudança : exploração do ensino do design focado em inovação social e sustentabilidade

ABSTRACT : This paper, part of a Ph.D. in Design research, focused on discussing the role of Design Education on training future designers to be actors of change. It describes the methodology of a workshop for design students during the Design Week of Mérida, at Universidad de Extremadura – Spain. The workshop discussed the point of view of students in problem-solving, and what they believe to be the skills, methods, and partnerships for design to achieve such a change in its approach and how Design Education plays a part in preparing the future genera_on of designers to tackle social innovation and sustainability problems. The results showed how these particular group of future designers see as crucial in the given context and the possibilities for improvement on a system that struggles to be resilient and respond at a faster pace.O presente trabalho é parte do projeto de investigação para o programa de Doutoramento em Design e foca em discutir o papel do Ensino do Design na educação de futuros designers como agentes de mudança. O artigo descreve a metodologia aplicada a um workshop facilitado para alunos de design durante a Semana de Design de Mérida, na Universidad de Extremadura, em Espanha. A atividade discutiu os pontos de vista dos estudantes no tocante à resolução de problemas complexos e suas crenças sobre as habilidades, métodos e parcerias necessárias ao Design para que alcance as mudanças necessárias, para além de discutir o papel do Ensino do Design na preparação da futura geração de profissionais focados na resolução de problemas de sustentabilidade e inovação social. O resultado demonstra o que este particular grupo de futuros designers entendem como sendo crucial neste contexto e as possibilidades para melhorias em um sistema que sofre para se tornar resiliente e responder às questões sociais de maneira mais ágil.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Production and characterization of different types of malaria pigment (hemozoin) and their potential use for screening for hemozoin inhibiting drugs

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Malarial pigment, hemozoin, appears to modulate the immune system, however it remains controversial if it has stimulatory or inhibitory effects. Biological properties may depend on the type of hemozoin, namely its origin and production method, morphology or size. Natural hemozoin can be obtained from P. falciparum cultures and identical β-hematin can be synthesized from heme. Characterization becomes crucial to confirm size, shape and possible contaminations. Hemozoin production is also a unique antimalarial drug target. There are several heme inhibition assays to screen for drugs with the potential to inhibit hemozoin growth. Yet, these assays are often complex, use highly concentrated, toxic reagents, and not all confirm the end product’s nature. This work aimed to produce and characterize natural hemozoin and synthetic hemozoin, as well as hemozoin-like crystals. Hemozoin-like crystals growth was also investigated to determine if drugs inhibit crystallization, and adapted in an assay format to explore their potential to screen for hemozoin-inhibiting drugs. Hemozoin obtained from different origins was characterized by several methods, including scanning electron microscopy, X-ray diffraction and infrared spectroscopy. Hemozoin-like crystals were grown in broth medium with different drugs to investigate their ability to inhibit crystallization. Despite an overall similarity in morphology and size, differences were detected and characterized between different types of hemozoin, which may be biologically relevant. Although very similar, X-ray diffraction and infrared spectroscopy showed that hemozoin-like crystals were not true hemozoin. However, inhibition results were consistent with previous heme inhibition studies, with chloroquine and amodiaquine presenting the highest potency, followed by other quinolines such as quinine and mefloquine. In conclusion, hemozoin used in immunology should be thoroughly characterized by several complementary methods. Hemozoin-like crystals growth could be successfully used as a novel assay to screen compounds for their hemozoin inhibiting activity, and may be a helpful tool for antimalarial drug screening.A malária, uma das mais importantes doenças infecciosas da actualidade, permanece um problema de saúde pública a nível global, atingindo regiões tropicais e subtropicais em todo o mundo. Esta doença causa grande morbilidade e mortalidade e contribui para o atraso no desenvolvimento social e económico dos países afectados. A doença é causada por parasitas do género Plasmodium, transmitidos por fêmeas de algumas espécies de mosquito Anopheles. Após a fase sexual no mosquito e a fase hepática do ciclo de vida do parasita no Homem, é durante a fase sanguínea que se manifestam os sintomas da doença febril. Factores do hospedeiro e do parasita poderão contribuir para o desenvolvimento de malária severa, levando eventualmente à morte do doente, sendo que a espécie Plasmodium falciparum é responsável pelo maior número de mortes associadas a malária. Apesar dos esforços travados por organizações internacionais no sentido de combater este flagelo, os programas de controlo e erradicação da malária enfrentam vários obstáculos, como a resistência aos insecticidas usados para impregnar redes mosquiteiras, a inexistência de uma vacina eficaz e, principalmente, a grande disseminação de estirpes de parasitas resistentes aos fármacos anti-maláricos actualmente disponíveis. Ainda que sejam pontuais os relatos de resistência ao quinino, utilizado desde o século XVII, este provoca graves efeitos secundários. Independentemente do sucesso de fármacos sintetizados durante o século passado, compostos como a cloroquina, a mefloquina e os antifolatos são hoje inúteis em muitas regiões do mundo. Não obstante a notável eficácia das artemisininas, estes fármacos podem escassear e tornam-se bastante dispendiosos, devendo ser administrados apenas em combinação com outros, de forma a evitar a propagação de resistência. Assim, é urgente descobrir novos fármacos eficazes no combate à malária. O pigmento malárico, também designado hemozoína, é o produto da desintoxicação de moléculas de heme livre, formado por biocristalização no parasita durante a fase intraeritrocítica, após digestão do conteúdo celular do eritrócito infectado. Pensa-se que fármacos anti-maláricos pertencentes à classe das quinolinas interajam com as moléculas de heme, inibindo este processo de biocristalização e resultando na acumulação de heme livre tóxico responsável pela morte do parasita. Alguns autores defendem que as artemisininas actuam de forma semelhante, apesar de este ser assunto de debate. Esta via de desintoxicação de heme pelo parasita é bastante interessante no desenvolvimento de novos fármacos, já que é exclusivo do parasita e parece ser imutável, devido ao facto de não depender de enzimas codificadas pelo parasita passíveis de sofrer alterações por mutações que estivessem na origem de resistência. Existem várias abordagens para investigação e descoberta de fármacos cujo alvo é a formação da hemozoína. Os ensaios in vitro de inibição da cristalização de heme tentam mimetizar a formação de hemozoína recorrendo à síntese de β-hematina, hemozoína sintética considerada idêntica à hemozoína natural, e permitem identificar compostos com potencial para inibir o crescimento do cristal. Todavia, ensaios diferentes variam grandemente em termos dos resultados que produzem e dos próprios métodos e condições utilizados para a sua realização, e nem sempre são suficientemente reprodutíveis nem de simples execução. O presente estudo teve como objectivo produzir e caracterizar hemozoína de diferentes origens, investigar a capacidade de vários fármacos para inibir o crescimento de cristais semelhantes a hemozoína, e o potencial destes cristais para identificar compostos antimaláricos inibidores da formação de hemozoína. A hemozoína sintética foi obtida por catálise acídica, ao passo que a hemozoína nativa foi obtida quer por purificação, quer por simples extracção a partir de culturas de eritrócitos humanos infectados com P. falciparum. Os cristais semelhantes a hemozoína foram cultivados num meio bem definido suplementado com extracto de sangue. Os cristais produzidos foram caracterizados recorrendo a microscopia óptica, de polarização e microscopia electrónica de varrimento, bem como a difracção raio-X e espectroscopia de infravermelho, e investigados em relação à presença de contaminação por heme, Mycoplasma, DNA ou proteína. Os cristais semelhantes a hemozoína foram ainda cultivados em microplaca na presença ou ausência de vários antibióticos e fármacos antimaláricos. Numa primeira abordagem para a caracterização da hemozoína produzida, que visualmente se apresenta preta em suspensão ou pó seco, a microscopia óptica e de polarização permitiram observar algumas diferenças morfológicas, de cor e depolarização entre os cristais obtidos por diferentes métodos. A microscopia electrónica de varrimento revelou-se talvez o método mais adequado para avaliar a morfologia e homogeneidade, evidenciando a forma de paralelepípedo dos cristais de origem nativa e a forma acicular dos cristais de origem sintética e dos cristais semelhantes a hemozoína. Todavia, apenas recorrendo à difracção raio-X e à espectroscopia de infravermelho foi possível distinguir inequivocamente os cristais semelhantes a hemozoína dos cristais de verdadeira hemozoína. Quando purificada, a hemozoína de origens natural e sintética apresenta ausência dos contaminantes investigados, ao passo que a hemozoína nativa extraída, não purificada, se encontra associada a proteínas e ácidos nucleicos. Ainda assim, e apesar de alguns estudos sugerirem um papel de estimulação do sistema imunitário para a hemozoína, a presença de proteínas e DNA pode ser interessante, caso se considere que a hemozoína poderá ser libertada dentro do vacúolo digestivo intacto ou associada a reminiscências desta ou de outras estruturas do parasita. A contaminação com uma quantidade apreciável de heme em cristais semelhantes a hemozoína contribuiu para estabelecer a diferença relativamente à verdadeira hemozoína. A quantificação realizada com o QuantiChrom™ Heme Assay Kit permitiu tirar partido da optimização para amostras de origem biológica e evita o uso de reagentes tóxicos. A obtenção de hemozoína de origem natural foi morosa e dispendiosa, ao passo que a produção de hemozoína sintética e cristais semelhantes a hemozoína foi mais simples e económica. O IFDO (do inglês Ileal Fluid Dependent Organism) foi descrito por Burdon em 1989 após ter sido isolado do fluido de ileostomia de indivíduos com a doença de Crohn. Além de organismo auto-replicativo, pensou-se poder ser uma espécie de cristal formado por constituintes do meio. Semelhante a priões no respeitante à resistência a desinfecção e esterilização, a empresa Steris interessou-se pelo seu potencial como modelo para investigar este tipo de processos, e confirmada a sua natureza hémica, além da birrefringência e cor castanha, pensou-se que poderia ser hemozoína. Apesar da semelhança, uma caracterização mais completa em colaboração com a Steris revelou a diferença dos cristais, e estes foram então designados cristais semelhantes a hemozoína. A avaliação de compostos anti-maláricos e antibióticos como possíveis inibidores do crescimento dos cristais semelhantes a hemozoína permitiu criar um ensaio in vitro para identificar compostos cujo alvo seja a formação de hemozoína. Observando a microplaca após a incubação do cristal na presença de diferentes concentrações de fármaco, foi possível observar visualmente a presença ou ausência de um precipitado escuro no fundo do poço que indicam respectivamente o crescimento ou a inibição da formação dos cristais semelhantes a hemozoína. O presente trabalho reforça a importância da caracterização da hemozoína obtida a partir de diferentes origens. Deve recorrer-se a vários métodos complementares para avaliação da morfologia, tamanho e identidade dos cristais, e testar a presença de moléculas contaminantes que possam apresentar propriedades químicas e biológicas em estudos imunológicos. Contribuir-se-á desta forma para esclarecer resultados ambíguos na investigação do papel da hemozoína na modulação do sistema imunitário do hospedeiro, bem como na avaliação da actividade de antimaláricos por inibição da formação do cristal. Os resultados obtidos sugerem ainda que o ensaio de inibição do crescimento dos cristais semelhantes a hemozoína pode ser usado a par dos ensaios existentes para testar compostos em relação à sua actividade de inibição da formação de hemozoína. O ensaio de inibição do crescimento dos cristais semelhantes a hemozoína é simples de realizar e requer infraestruturas laboratoriais básicas e reagentes relativamente económicos, podendo contribuir assim para a descoberta de novos antimaláricos e para os esforços no controlo da malária

Rumo aos desafios da economia circular : ferramentas de apoio a uma nova estratégia na prática de design

ABSTRACT : The circular economy is a new strategic concept to meet society's needs in a more efficient and sustainable manner based in decoupling the economic growth and welfare from the increase in the consumption of natural resources. It implies the transition from the traditional linear model to a more innovative and circular approach in the development of the economy by designing new products, new services, and new systems, supported, in most cases, by the re-thinking and creation of new business models. Designers and product developers have an important and crucial role to achieve a successful and wide implementation of the concept which has to be accepted and applied in practice by businesses along the whole value chain and meet the current and future needs of consumers and the society. Currently, several methods, principles, practices, tools, training initiatives, and many resources are being developed globally as a result of the wide exploitation of the concept, but there is still a large gap between what is available to companies and designers, and what is applied in practice on product and service development. This paper reflects part of the PhD research project under development by the authors which is based on the promotion of the design practice within Circular Economy. It explores the results of the review of circularity tools available that can be used by design professionals to systematize and guide their development process. The analysis will support the development of a toolkit and guidelines oriented for the practical implementation of the circular economy in the development of innovative and efficient products and services. (Camocho, Ferreira, & Vicente, 2018).A economia circular é um novo conceito estratégico que visa responder às necessidades da sociedade de uma forma mais eficiente e sustentável que se baseia na dissociação entre crescimento económico e bem-estar do aumento do consumo de recursos naturais. Esta transição, do modelo linear tradicional para uma abordagem mais inovadora e circular no desenvolvimento da economia implica o desenvolvimento de novos produtos, novos serviços e novos sistemas, apoiados, na maioria dos casos, no repensar e na criação de novos modelos de negócio. Os designers e os responsáveis pelo desenvolvimento de produtos têm um papel importante e crucial para alcançar uma implementação ampla e bem-sucedida do conceito. Este deve ser aceite e aplicado na prática pelas empresas ao longo de toda a cadeia de valor atendendo às necessidades atuais e futuras dos consumidores e da sociedade. Atualmente, vários métodos, princípios, práticas, ferramentas, iniciativas de formação e outros recursos têm sido desenvolvidos globalmente como resultado da ampla exploração do conceito, no entanto, ainda existe uma grande lacuna entre o que está disponível para empresas e designers e o que é aplicado na prática no desenvolvimento de produtos e serviços. Este artigo reflete parte do projeto de investigação de doutoramento em desenvolvimento pelos autores, o qual se baseia na promoção da prática de design no âmbito da Economia Circular. Explora os resultados da revisão de ferramentas de circularidade disponíveis que podem ser aplicadas pelos profissionais de design na sistematização e orientação do processo de desenvolvimento. Esta análise irá apoiar o desenvolvimento de um conjunto de ferramentas e orientações para a implementação prática da economia circular no desenvolvimento de produtos e serviços mais inovadores e mais eficientes. (Camocho, Ferreira & Vicente, 2018).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

A cultura humana e necessidades ecossistémicas como fundamentação da inovação no design de casas de banho

ABSTRACT: Proposed paper is a part of the ongoing PhD research in design with focus on the research of existing environmental and social requirements for the sustainable innovation within urban sanita_on, focused on toilet design. Main questions of the research are aiming the Portuguese environment, where we are characterizing aspects of water and sanita_on through the five dimensions - culture, technology, government, economy, and environment. In this paper the main objective is to determine systemic characteristics of the socio-cultural dimension of water and sanitation, which will be later incorporated in writien final guidelines – directives raised from the research results which shall serve as operational knowledge for the ones involved in the implementation of the sustainable toilet innovation. The paper as well serves as theoretical orientation for the practical applications of the research.O trabalho proposto faz parte da pesquisa de doutorado em andamento em design, com foco na pesquisa de requisitos ambientais e sociais existentes para a inovação sustentável no saneamento urbano, focada no design de banheiros. As principais questões da pesquisa estão voltadas para o ambiente português, onde caracterizamos aspectos de água e saneamento através das cinco dimensões - cultura, tecnologia, governo, economia e meio ambiente. Neste artigo, o objetivo principal é determinar características sistêmicas da dimensão sociocultural da água e saneamento, que serão incorporadas posteriormente às diretrizes finais escritas - diretrizes levantadas a partir dos resultados da pesquisa que servirão como conhecimento operacional para os envolvidos na implementação da inovação sustentável do banheiro. O artigo também serve como orientação teórica para as aplicações práticas da pesquisa.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Guimarães – Capital da Cultura 2012: Satisfação e comportamento dos visitantes

O turismo cultural é uma das áreas que tem suscitado interesse por parte dos turistas que, cada vez mais exigentes, procuram experiências marcantes. O aumento de visitantes em locais históricos, sítios arqueológicos, museus e outros locais, para participar e experimentar rituais e festividades tradicionais mostra o interesse crescente por este tipo de turismo. Os turistas culturais são altamente seletivos no consumo de recursos patrimoniais considerando, na maioria dos casos, o património tradicional uma mais-valia procurando a história e o mistério que envolve cada património a visitar (Besculides, Lee & Peter, 2002). O turismo cultural é um produto com um mercado vasto, mas com uma necessidade reforçada de ser diferenciador devido ao tipo de consumidor seletivo e exigente. O principal objetivo deste trabalho é avaliar as motivações e satisfação dos turistas que participaram no evento Guimarães – Capital Europeia da Cultura 2012 (CEC 2012).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Biorefinaria marinha: valorização de algas para produtos de valor acrescentado

The consumption paradigm is changing. Consumers are more attentive to what they consume and to the sustainability questions addressed to those products. This change was driven by the healthy label given to natural products but also by the urgent need to find more sustainable sources of raw materials and to implement processes as a way to mitigate climate changes, without compromising the quality and affecting the price of the final product. Pigments are compounds that can be obtained from various sources of biomass, being recognized by their numerous biological activities. Due to their spectral and biological properties, pigments can find application in many fields, from food to cosmetics, nutraceutics, and medicine. However, conventional methodologies to obtain pigments demand very often the use of costly equipment and/or toxic organic solvents. In this work, alternative methodologies to extract and purify pigments from algae of were developed. Simple and efficient methodologies mostly based on aqueous solvents were used to recover one or more pigments from algae within a blue biorefinery framework. In all chapters, a variety of solvents were screened, and operational conditions were studied and optimized in order to reach high yields of extractions and/or purities. Aqueous solutions of tensioactive ionic liquids have shown great potential for the recovery of hydrophobic pigments such as chlorophylls and carotenoids. In the other hand, induced precipitation of proteins is shown to be a good alternative for the selective precipitation (and further purification) of phycobiliproteins. Economic and environmental impacts were assessed and encouraging results were obtained from both perspectives, leading us to believe in the potential for the industrial implementation of some of the results here obtained.O paradigma do consumo está a mudar. Os consumidores estão mais atentos ao que consomem e a questões relacionadas com a sustentabilidade desses produtos. Esta mudança foi motivada pelo cuidado de saúde associado ao consumo de produtos naturais, mas também pela necessidade de implementar recursos e processos mais sustentáveis como forma de combater as mudanças climáticas, sem comprometer a qualidade e o preço do produto final. Os pigmentos são uma das classes de compostos que podem ser obtidos a partir de biomassa, sendo reconhecidos pelas suas inúmeras atividades biológicas. Pelas suas propriedades espectrais e biológicas, os pigmentos podem ser aplicados em diversos setores de atividade que vão desde a alimentação humana, à cosmética, nutracêutica e medicina. Contudo, as metodologias convencionais para obtenção de pigmentos exigem frequentemente o uso de equipamento dispendioso e/ou o uso de solventes orgânicos considerados tóxicos. Nesta tese, processos de extração e purificação alternativos para recuperar os pigmentos de algas foram desenvolvidos e propostos. Metodologias simples e eficientes, maioritariamente baseadas em solventes aquosos, foram usadas para obter um ou mais pigmentos de uma mesma alga. Em todos os capítulos apresentados, um conjunto de solventes foi testado assim como foram estudadas as condições operacionais de forma a atingir os melhores rendimentos e/ou purezas. Soluções aquosas de líquidos iónicos tensioativos mostraram um enorme potencial, sob várias perspetivas, na obtenção de pigmentos hidrofóbicos tais como clorofilas e carotenoides. Por outro lado, a precipitação induzida de proteínas provou ser uma boa alternativa na precipitação seletiva (e consequente purificação) de ficobiliproteinas. Os impactos económicos e ambientais foram estudados e resultados encorajadores foram obtidos de ambos as perspetivas, levando-nos a acreditar no sucesso da implementação industrial de alguns dos trabalhos apresentados.Programa Doutoral em Engenharia Químic

Sustainable crowdfunding and backers : information processing and the role of social media fatigue

To establish a successful project and achieve the financial target, entrepreneurs must collect supporters to endorse their initiative. Considering the increasing difficulty of launching a new business or brand and securing the necessary financing, entrepreneurs often use crowdfunding. Crowdfunding has piqued the interest of academics from a wide range of areas of study, such as economics and psychology due to the nature of the process and the demand for social circles. Psychology can provide a specific contribution to the study of crowdfunding by assessing how and why crowdfunding profiles can be more appealing to potential supporters, through the study of how potential backers process information contained in those profiles. This work looks at how individuals digest information about sustainable crowdfunding projects by focusing on how different features of the profiles presenting these projects appeal to the different cognitive systems every individual use, i.e. system 1 (more intuitive, supported by heuristics) vs. system 2 (more thorough and supported by cognitive resources). Furthermore, this study also assesses how social media fatigue affects the preference for crowdfunding profiles and whether it interacts with the use of the different systems. The study sample consisted of 88 individuals, and the results reveal that people are more prone to financially support sustainable crowdfunding profiles that appeal to system 1, regardless of the levels of social media fatigue.Para estabelecer um projeto de sucesso e atingir a meta financeira, os empreendedores devem coletar apoiantes (investidores) para endossar os seus projetos. Considerando a dificuldade crescente de lançar um novo negócio ou marca e garantir o financiamento necessário, os empreendedores começaram a usar crowdfunding. O crowdfunding tem despertado o interesse de acadêmicos de diversas áreas de estudo, como economia e psicologia, devido à natureza do processo e à demanda por círculos sociais. A psicologia pode dar um contributo específico para o estudo do crowdfunding ao avaliar como e porque os perfis de crowdfunding podem ser mais apelativos para potenciais apoiantes, através do estudo de como os potenciais financiadores processam as informações contidas nesses perfis. Este trabalho analisa como os indivíduos digerem informações sobre projetos de crowdfunding sustentáveis, concentrando-se em como as diferentes características dos perfis que apresentam esses projetos atraem os diferentes sistemas cognitivos que cada indivíduo usa, ou seja, sistema 1 (mais intuitivo, suportado por heurísticas) vs. sistema 2 (mais completa e apoiada por recursos cognitivos). Além disso, este estudo também avalia como a fadiga das redes sociais afeta a preferência por perfis de crowdfunding e se ela interage com o uso dos diferentes sistemas. A amostra do estudo foi composta por 88 indivíduos, e os resultados revelam que as pessoas são mais propensas a apoiar financeiramente perfis de crowdfunding sustentáveis que apelam ao sistema 1, independentemente dos níveis de fadiga das redes sociais

Análise lipidómica de células mesenquimais candidatas a terapia celular

Mestrado em Bioquímica - Métodos BiomolecularesMesenchymal stromal cells are adult stem cells found mostly in the bone marrow. They have immunosuppressive properties and they have been successfully applied as biological therapy in several clinical trials regarding autoimmune diseases. Despite the great number of clinical trials, MSCs’ action is not fully understand and there are no identified markers that correlate themselves with the immunomodulatory power. A lipidomic approach can solve some of these problems once lipids are one of the major cells’ components. Therefore, in this study cells’ lipidome was analysed and its deviations were evaluated according to the medium of culture and to the presence of pro-inflammatory stimuli, mimicking physiological conditions in which these cells are used. This was the first study ever made that aimed to analyse the differences in the phospholipid profile between mesenchymal stromal cells non-stimulated and stimulated with proinflammatory stimulus. This analysis was conducted in both cells cultured in medium supplemented with animal serum and in cells cultured in a synthetic medium. In cells cultured in the standard medium the levels of phosphatidylcholine (PC) species with shorter fatty acids (FAs) acyl chains decreased under pro-inflammatory stimuli. The level of PC(40:6) also decreased, which may be correlated with enhanced levels of lysoPC (LPC)(18:0) - an anti-inflammatory LPC - observed in cells subjected to TNF-α and IFN-γ. Simultaneously, the relative amounts of PC(36:1) and PC(38:4) increased. TNF-α and IFN- γ also enhanced the levels of phosphatidylethanolamine PE(40:6) and decreased the levels of PE(38:6). Higher expression of phosphatidylserine PS(36:1) and sphingomyelin SM(34:0) along with a decrease in PS(38:6) levels were observed. However, in cells cultured in a synthetic medium, TNF-α and IFN-γ only enhanced the levels of PS(36:1). These results indicate that lipid metabolism and signaling is modulated during mesenchymal stromal cells action.As células mesenquimais do estroma são células estaminais adultas que apresentam propriedades imunossupressoras e têm sido aplicadas como terapia clínica em vários estudos clínicos relativos a doenças autoimunes. Apesar do vasto número de estudos clínicos que utilizam estas células, ainda não se conhece o mecanismo de ação das mesmas, nem foram ainda identificados marcadores permitam avaliar o seu potencial imunomodulador. A lipidómica poderá dar algumas respostas a estas questões uma vez que os lípidos são importantes componentes das células, desempenhando um papel na sinalização celular. No presente trabalho estudou-se o lipidoma das células mesenquimais e avaliou-se a sua variação consoante o meio de cultura e a presença de estímulos próinflamatórios, mimetizando as condições fisiológicas em que as células são utilizadas. Este foi o primeiro estudo que analisou as diferenças no perfil fosfolípidico entre células mesenquimais do estroma e avaliou a variação do lipidoma destas células após a sua estimulação por mediadores pró-inflamatórios. Este estudo foi conduzido num primeiro conjunto de células cultivado num meio padrão suplementado com soro animal e num segundo conjunto de células cultivado num meio sintético. Nas células cultivadas no meio padrão, observou-se uma diminuição nas espécies moleculares de fosfatidilcolina (PC) com cadeias de ácidos gordos (FAs) após estímulos pro-inflamatórios. A quantidade de PC(40:6) também diminuiu, relacionando-se com o aumento expressão de lisoPC (LPC)(18:0) – LPC anti-inflamatória – em células estimuladas. Simultaneamente, a quantidade relativa de PC(36:1) e PC(38:4) aumentou. TNF-α and IFN-γ também levou ao aumento dos níveis de fosfatidiletanolamina PE(40:6) e diminuiu os níveis de PE(38:6). Também se verificou um aumento da expressão de fosfatidilserina PS(36:1) e esfingomielina (SM)(34:0), bem como a diminuição na expressão de PS(38:6). Contudo, em células mesenquimais cultivadas em meio sintético, com TNF-α and IFN-γ apenas aumentaram os níveis de PS(36:1). Estes resultados indicam que o metabolismo dos lípidos é modulado durante a ação imunossupressora das células

Depicting epigenetic mechanisms involved in the regulation of pseudogene expression

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A epigenética dedica-se ao estudo de modificações que ocorrem, principalmente, sobre a dupla cadeia de DNA, sem que exista a edição da sequência nela contida (Waddington 1942b, 1942a). Graças às descobertas feitas nesta área nos últimos anos, existem vários tipos de modificações epigenéticas já descritas, entre as quais se destaca as modificações de histonas e a metilação do DNA (Li et al. 2007). Assim, avaliando a presença ou ausência destas modificações, poderemos inferir relativamente à activação ou silenciamento de uma determinada região do genoma. Vários estudos têm sido realizados para caracterizar a forma como estas modificações afectam a transcrição de genes codificadores de proteína (Kouzarides 2007), no entanto, pouco se sabe como estas modificações podem condicionar outras classes de genes, nomeadamente, os pseudogenes. Neste sentido, o objectivo deste trabalho consiste na determinação de modificações epigenéticas que possam estar envolvidas na expressão dos pseudogenes, potencialmente exercendo um papel crucial na sua regulação. Os pseudogenes são cópias ancestrais de sequências codificantes que, possivelmente devido à perda de pressão selectiva, degeneraram em novas unidades genéticas (Jacq et al. 1977). Actualmente, os pseudogenes são classificados em três grandes grupos que são definidos com base no seu processo de formação: processados, a classe de pseudogenes mais representada e cuja formação envolve um processo de transcrição reversa e integração de um RNA mensageiro novamente no DNA, num processo conhecido por retrotransposição; não processados, no caso do processo de formação do pseudogene acontecer através da duplicação de um gene completo; e unitários, quando a própria estrutura física do gene sofre modificações que levam à perda da capacidade de codificar uma proteína (Pink et al. 2011). O processo de formação dos pseudogenes que resulta na incapacidade do novo pseudogene codificar uma proteína denomina-se “pseudogenização” (Gregório 2016). Graças ao recente desenvolvimento de plataformas de sequenciação em larga escala, revelou-se que os pseudogenes são transcritos e que a sua transcrição pode estar envolvida na condução de importantes processos celulares nos quais os pseudogenes podem desempenhar funções celulares específicas. Presentemente, sabe-se que os pseudogenes conseguem também actuar através de diferentes mecanismos para modular a regulação dos seus genes parentais, nomeadamente através da competição para esponjas de microRNAs (Thomson and Dinger 2016), transcritos antisense ou lncRNAs com a capacidade de conduzir complexos proteicos remodeladores de cromatina (Groen et al. 2014). Para além desta actuação mediada por RNA através dos potenciais transcritos dos pseudogenes, pensa-se também que os pseudogenes podem ter mecanismos de acção ao nível do DNA que podem condicionar a actividade do gene parental, por exemplo através de um evento de recombinação homóloga entre o pseudogene e o gene parental que pode resultar na deleção do gene parental (Poliseno 2012). Dada esta possível contribuição em vários processos celulares, os pseudogenes definem um novo paradigma de como o genoma não codificante pode ter importantes contribuições em diversas funções biológicas, nomeadamente no desenvolvimento e no cancro. Um exemplo destas contribuições é o pseudogene Oct4p4, que tem a capacidade de regular a transcrição do seu gene parental, o regulador de pluripotência Oct4. Quando expresso, este pseudogene conduz a célula a iniciar o processo de diferenciação neural, através da imposição da modificação repressiva da histona H3 (H3K9me3) na região promotora do gene Oct4 (Liedtke et al. 2007). Um outro exemplo de um pseudogene com uma função importante, neste caso em cancro, é o PTENP1, um pseudogene do gene supressor tumoral PTEN. O PTENP1 é o exemplo de um pseudogene com diversificados mecanismos de acção através de um único pseudogene conseguindo actuar como uma esponja de microRNAs, um catalisador do recrutamento de remodeladores da cromatina para o promotor do gene PTEN e um transcrito antisense que consegue regular a estabilidade e a função de esponja de microRNAs do próprio transcrito sense do PTENP1 (Johnsson et al. 2013). Contudo, os mecanismos pelos quais a expressão dos pseudogenes é regulada e qual o seu papel biológico estão ainda por explorar. Grande porção dos pseudogenes não aparentam ter sequências regulatórias a montante do corpo do pseudogene, o que pode sugerir que outros mecanismos poderão estar envolvidos neste processo, em resultado da observação de modificações nas histonas de pseudogenes que são transcritos e que não são características nos seus genes parentais ou nos restantes genes codificadores de proteínas (Pei et al. 2012). Um destes exemplos é a presença de H3K9me3 na região do promotor de pseudogenes expressos (Guo et al. 2014). Tendo em consideração estas observações, propomos a hipótese que os pseudogenes possuem mecanismos epigenéticos próprios a regular a sua transcrição. Para testar esta hipótese, estudámos o transcriptoma e epigenoma dos pseudogenes durante a diferenciação neural de células estaminais embrionárias, através da combinação de análises de dados em larga de escala do transcriptoma (RNAseq e GRO-seq), metilação de DNA (BS-seq), regiões de cromatina aberta (hipersensibilidade à DNase) e modificações de histona (ChIP-seq). Os dados usados foram obtidos através da plataforma NIH Roadmap Epigenomics Consortium (Bernstein et al. 2010), consistindo em 72 amostras e um total de 194 replicados. Devido à elevada expressão de pseudogenes no cérebro (Pei et al. 2012), este projecto incidiu essencialmente na diferenciação neural, durante a qual células estaminais embrionárias (H1) foram diferenciadas in vitro em células progenitoras neuronais (H1N). As nossas análises referentes ao transcriptoma revelaram um número mais elevado de pseudogenes a serem expressos durante a diferenciação neural quando comparado com a diferenciação mesenquimal. No entanto, observámos que a detecção da transcrição dos pseudogenes pode ser incorrectamente determinada usando dados de RNA-seq, pois os perfis obtidos por esta tecnologia são influenciados pela estabilidade dos transcritos. Em concordância, os resultados obtidos usando dados de GRO-seq suportam esta hipótese, dado que permitem identificar um maior número de pseudogenes a serem transcritos. Após a identificação dos pseudogenes transcritos e silenciados, analisámos o seu enriquecimento em modificações de histonas. De todas as alterações observadas, destacamos três importantes observações associadas com a transcrição de pseudogenes, nomeadamente a presença de: H3K36me3 no corpo do pseudogenes transcritos, associada a episódios de continuação da transcrição do gene na região a montante (“read-through”); H3K9me3, uma marca epigenética usualmente associada a regiões não transcritas; e, por fim, domínios bivalentes (H3K4me3 e H3K27me3) na região promotora de alguns pseudogenes. Estas observações parecem sustentar a hipótese que sugere que a transcrição dos pseudogenes é regulada. Estudos mais profundos são necessários para perceber a extensão destas modificações na expressão dos pseudogenes, apesar da presença de H3K36me3 e H3K9me3 terem sido já observadas previamente em pseudogenes transcritos (Pei et al. 2012; Guo et al. 2014). No entanto, são ainda muitas as limitações associadas ao estudo dos pseudogenes e que precisam de um melhoramento no futuro. Primeiramente, a semelhança existente entre pseudogenes e os genes parentais dificulta o mapeamento destas regiões usando dados de sequenciação de transcriptoma. Adicionalmente, a expressão de pseudogenes por “read-through” do gene a montante pode sugerir a existência de erros na anotação de bases de dados e pressiona para a crescente necessidade de melhoramento na caracterização de genomas. Concluindo, os resultados aqui observados e discutidos confirmam que os pseudogenes são transcritos e que a sua transcrição parece ser regulada, sugerindo que o seu papel não será assim tão “pseudo” como previamente se pensava. Contudo, mais esforços são necessários para caracterizar a extensão destas alterações, bem como para aferir a contribuição da metilação do DNA na regulação da expressão dos pseudogenes.Pseudogenes are genetic elements that derive from normal protein-coding genes which, through the accumulation of deteriorating mutations, have lost coding potential in a process which is known as “pseudogenization”. However, recent high throughput sequencing technology has shown that pseudogenes are transcribed and that their transcription is tissue-specific, which suggests that pseudogenes might have an important role in biological processes. Many pseudogenes have been described to regulate important processes in development or cancer. Yet, not much is known about how pseudogene expression is regulated. Most pseudogenes seem to have lost their upstream regulatory sequences, indicating that trans-acting mechanisms might be responsible for this regulation. Studies evidence that pseudogenes have different histone modifications compared to their parental genes, suggesting that they might have specific transcriptional mechanisms. In this project, we aimed at identifying the epigenetic pattern responsible for the regulation of pseudogene transcription through a genome-wide analysis. For this analysis, we used transcriptomic data (RNA-seq and GRO-seq) to detect pseudogene transcription and epigenomic data (ChIP-seq, DNase Hypersensitivity and WGBS-seq) to assess epigenomic changes in silent and expressed pseudogenes. Since pseudogene expression has been shown to be higher in the brain, we choose to address our research questions using in vitro neural differentiation of embryonic stem cells (ESCs) as a cell differentiation model system. Our analysis confirmed that there are more pseudogenes being expressed during neural differentiation when compared to mesenchymal differentiation. Regarding their epigenetic modifications, our results show that some pseudogenes, in which the histone modification H3K36me3 is present, might be transcribed as a consequence of transcription read-through from the upstream gene. Expressed pseudogenes also seem to be enriched with the histone modification H3K9me3, a modification that is known to be associated with inactive transcription. As well as in protein-coding genes and lncRNAs, pseudogenes are enriched with bivalent promoters features, such as the colocalized presence of H3K4me3 and H3K27me3 in both undifferentiated and neural differentiated cell lines. To conclude, although the regulation of pseudogene transcription still requires further work to truly apprehend the epigenetic mechanisms that contribute to pseudogene expression, our work has confirmed that mainly histone modification such as H3K36me3 and H3K9me3 may indeed play a role, either direct or indirect, that can help modulate the expression of these very particular genes